Η κυτταρομετρία ροής, μια νέα πηγή για τον οινολόγο

Ο οίνος είναι προϊόν μιας πολύπλοκης διαδικασίας, με τη μεσολάβηση μικροοργανισμών, επομένως η παρακολούθηση της μικροχλωρίδας που λειτουργεί μέσα στις δεξαμενές είναι απαραίτητη. Ωστόσο, ενώ η αναλυτική χημεία που εφαρμόζεται στην οινολογία μπορεί να υπερηφανεύεται για σύγχρονες ενόργανες τεχνικές, μένουν πολλά να γίνουν σχετικά με την παρακολούθηση των ζυμομυκήτων και των βακτηρίων. Η αναλυτική οινολογική μικροβιολογία εξακολουθεί να συνδέεται σε μεγάλο βαθμό με καλλιεργητικές τεχνικές που περιλαμβάνουν την ανάπτυξη μικροοργανισμών σε συνθετικά μέσα. Αυτές οι τεχνικές αρχίζουν να αποτυγχάνουν να καλύψουν τις ανάγκες των οινοποιών για διάφορους λόγους. Η καλλιέργεια απαιτεί αφοσιωμένους χώρους και εξειδικευμένο προσωπικό και είναι μια «αργή» τεχνική. Οι μέθοδοι καλλιέργειας περιλαμβάνουν την καλλιέργεια ή ανάπτυξη μικροοργανισμών που υπάρχουν στο γλεύκος ή το κρασί. Η ταχύτητα ανάπτυξης εξαρτάται από τα χαρακτηριστικά των διαφορετικών μικροβιακών ειδών και στον αμπελοοινικό τομέα αυτά δεν είναι πολύ έντονα, απαιτώντας χρόνους που κυμαίνονται από τρεις έως δέκα ημέρες για πλήρη ανάπτυξη.

Αυτή η βραδύτητα σημαίνει ότι οι αναλύσεις που χρησιμοποιούν πολιτισμικές τεχνικές είναι ανεπαρκείς όταν η διαδικασία παραγωγής είναι γρήγορη, όπως στην περίπτωση των ζυμώσεων, ή όταν απαιτούνται γρήγορες αποκρίσεις για την άμεση επέμβαση για τη διόρθωση προβλημάτων ή αποκλίσεων (διακοπή ζύμωσης, παρουσία γαλακτικών βακτηρίων, παρουσία Brettanomyces ). Σήμερα, μια νέα ενόργανη προσέγγιση εμφανίζεται επίσης στα οινοποιεία που μπορεί να εγγυηθεί γρήγορα και ακριβή αποτελέσματα σε πολύ σύντομο χρονικό διάστημα: η κυτταρομετρία ροής. Η κυτταρομετρία ροής είναι μια οργανική αναλυτική τεχνική που βασίζεται στην αλληλεπίδραση μεταξύ των σωματιδίων που αιωρούνται σε ένα υγρό μέσο και του φωτός, που παράγεται από λέιζερ. Αυτή η τεχνική βρίσκει σήμερα εφαρμογή σε διάφορους τομείς της μηχανικής υλικών και της βιοϊατρικής επιστήμης. Στον τον τελευταίο τομέα η τεχνική επεκτείνεται και στον οινολογικό τομέα, χάρη και στη σημαντική μείωση του κόστους οργάνων που έχει παρατηρηθεί τα τελευταία χρόνια.

Πώς λειτουργεί όμως η κυτταρομετρία ροής;
Το αιώρημα κυψέλης συλλέγεται και αποστέλλεται στον θάλαμο ανίχνευσης από το σύστημα ρευστού του μηχανήματος το οποίο, χάρη σε συγκεκριμένο σχεδιασμό και αντλίες ακριβείας, καταφέρνει να ταξινομήσει τα κύτταρα σε μια διατεταγμένη στρωτή ροή, τοποθετώντας τα σε μια σειρά, ξεχωριστά (Εικόνα 1 ).

Εικόνες.1 Απλοποιημένο διάγραμμα λειτουργίας κυτταρομετρίας ροής
Εικόνες.1 Απλοποιημένο διάγραμμα λειτουργίας κυτταρομετρίας ροής

Τα κύτταρα περνούν μέσα από τον θάλαμο ανίχνευσης, όπου παρεμποδίζουν μια δέσμη φωτός που παράγεται από ένα λέιζερ. Η διέλευση των κυττάρων μέσω της δέσμης φωτός δημιουργεί σήματα που λαμβάνονται και ενισχύονται από διάφορους ανιχνευτές. Τα κύρια σήματα που παράγουν όλα τα σωματίδια (κύτταρα και άλλα) οφείλονται στην απλή παρουσία στερεών σε μια δέσμη φωτός και ονομάζονται «φυσικές παράμετροι». Οι φυσικές παράμετροι ήδη μας επιτρέπουν να λαμβάνουμε πληροφορίες για τη φύση του κυτταρικού πληθυσμού διαφοροποιώντας, σε διαστατική βάση, ζυμομύκητες από βακτήρια ή σε μορφολογική βάση, καθαρή καλλιέργεια ζυμομυκήτων από μικτή καλλιέργεια. Η δυνατότητα της κυτταρομετρίας ροής δεν σταματά εδώ. Χάρη σε ειδικές φθορίζουσες ουσίες είναι δυνατό να επισημανθούν διάφορα χαρακτηριστικά του κυτταρικού πληθυσμού, συμπεριλαμβανομένης της ζωτικότητας, των ειδικών μεταβολικών δραστηριοτήτων ή, σε συγκεκριμένες περιπτώσεις, του είδους προέλευσης.

Το Κέντρο Μεταφοράς Τεχνολογίας του Ιδρύματος Mach διαθέτει μακρά παράδοση στον τομέα της ανάλυσης και της παροχής συμβουλών στον τομέα του οίνου. Από το 2012 έχει αναπτύξει αναλυτικές εφαρμογές για την οινολογία, με βάση την κυτταρομετρία ροής (Εικόνα 2).

Εικ.2 Κυτταρομετρία ροής που παρέχεται στο μικροβιολογικό εργαστήριο του Mach Foundation (TN), εξοπλισμένο με 8 κανάλια ανίχνευσης και χρησιμοποιείται για την ανάλυση διαφόρων οινολογικών δειγμάτων.

Η πρώτη εφαρμογή είναι ο ποιοτικός έλεγχος των ενεργών ξηρών ζυμών που χρησιμοποιούνται στην οινοποίηση. Τα αποτελέσματα της σύγκρισης μεταξύ κυτταρομετρικής ανάλυσης ροής και παραδοσιακών μεθόδων καλλιέργειας είναι θετικά.

Εικ.3 Σύγκριση μεταξύ μετρήσεων για τον αριθμό των ζωντανών κυττάρων σε ενεργούς ξηρούς ζυμομύκητες που πραγματοποιήθηκαν με μέτρηση τρυβλίου Petri σύμφωνα με τη μέθοδο OIV και με κυτταρομετρία ροής. Η διαφορά μεταξύ των προσδιορισμών εμπίπτει στο εύρος αβεβαιότητας της μεθόδου OIV και επομένως δεν είναι σημαντική.

Δεκάδες δείγματα ενεργού ξηρού ζυμομύκητα αναλύθηκαν στα εργαστήρια του Mach Foundation, συγκρίνοντας τον προσδιορισμό των κυττάρων με το κυτταρόμετρο ροής με τον αριθμό των πλακών σύμφωνα με την επίσημη μέθοδο OIV. Στις περισσότερες περιπτώσεις, οι προσδιορισμοί που λαμβάνονται με τη κυτταρομετρία ροής εμπίπτουν στο εύρος αβεβαιότητας του αριθμού πλακών (Εικόνα 3), η ανάλυση των διαφορών μεταξύ των δύο μεθόδων δεν επισημαίνει σημαντικές αποκλίσεις εκτός από χαμηλά επίπεδα κυτταρικού φορτίου, όπου η τεχνική κυτταρομετρίας ροής είναι σε θέση να μετρήσει κύτταρα ζυμομύκητα με υψηλή πίεση, που δεν μπορούν να αναπτυχθούν σε ένα τρυβλίο Petri.

Επιπλέον, η κυτταρομετρική ανάλυση ροής έδωσε μια περαιτέρω χρήσιμη παράμετρο, τον αριθμό των νεκρών κυττάρων που υπάρχουν στην ξηρή μαγιά, έναν δείκτη της ποιότητας του μικροβιολογικού σκευάσματος και τις καταπονήσεις που υπέστη κατά τη διαδικασία παραγωγής και διατήρησης. Σε σύγκριση με τον αριθμό των πλακών σύμφωνα με τη μέθοδο OIV, είμαστε επομένως σε θέση να λάβουμε μεγαλύτερο όγκο πληροφοριών και σε λιγότερο χρόνο: η κυτταρομετρική ανάλυση ροής του LSA, λαμβάνοντας επίσης υπόψη τις προκαταρκτικές φάσεις επανυδάτωσης του δείγματος, δεν απαιτεί περισσότερα από 30 λεπτά, σε σύγκριση με τις 3-4 ημέρες που απαιτούνται με τις μετρήσεις των πιάτων.

Μια άλλη εφαρμογή στον τομέα του οίνου είναι η παρακολούθηση της δεύτερης ζύμωησης στη φιάλη κατά την παραγωγή αφρωδών οίνων με την κλασική μέθοδο. Είναι γνωστό ότι η δευτερογενής ζύμωση των αφρωδών οίνων είναι μια λεπτή διαδικασία γιατί λαμβάνει χώρα στον οίνο, ένα δυσμενές περιβάλλον για τη δραστηριότητα της ζύμης. Η κυτταρομετρία ροής παρουσιάζεται ως μια ενδιαφέρουσα εναλλακτική λύση της μικροσκοπικής μέτρησης. Μέσω της χρήσης δύο διαλυμάτων φθορισμού είναι δυνατός ο διαχωρισμός των ζωντανών κυττάρων από τα νεκρά κύτταρα με εξαιρετική ακρίβεια, αλλά και ο ποσοτικός προσδιορισμός των ζυμών που παρουσιάζουν σημαντική βλάβη στην κυτταρική μεμβράνη.

Εικ.4 Κυτταρομετρική ανάλυση ροής του πληθυσμού ζυμομύκητα που υπάρχει σε αφρώδη οίνο κλασικής μεθόδου κατά την αναφορά. Διακρίνονται τρεις διαφορετικές ομάδες μικροοργανισμών, που αντιστοιχούν σε ζωτικά, νεκρά και κατεστραμμένα κύτταρα από τις αυστηρές συνθήκες που υπάρχουν στο κρασί (οινόπνευμα, χαμηλό pH κ.λπ.).

Η συχνότητα εμφάνισης αυτών των κυττάρων στον πληθυσμό του ζυμομύκητα είναι μια σαφής παράμετρος της κατάστασης της βιομάζας και μπορεί να καταστήσει δυνατή την αποτροπή διακοπής της ζύμωσης που θα προκαλούσαν σε κίνδυνο το προϊόν. Επίσης σε αυτή την περίπτωση, λοιπόν, η κυτταρομετρία ροής είναι σε θέση να παρέχει ακριβείς και εξαντλητικές απαντήσεις γρήγορα, της τάξης των είκοσι περίπου λεπτών (Εικόνα 4).

– Νικόλαος Αγοραστός

 

Add a Comment